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实验室常用试剂、缓冲液的配制方法

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1 M Tris-HCl (pH7.4,7.6,8.0)
组份浓度  1 M Tris-HCl
配制量  1L
配制方法  1.称量121.1 g Tris置于l L烧杯中。
 2.加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
 3.按下表加入浓HCl量调节所需要的pH值。
pH值  浓HCl
7.4  约70 ml
7.6  约60 ml
8.0  约42ml
4.将溶液定容至1 L。
5.高温高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高l℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

1.5 M Tris-HCl (pH8.8)  
  组份浓度  1.5 MTris-HCl
配制量  1 L
配制方法  1.称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中。
 2.加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
 3.用浓HCl调节pH值至8.8。
 4.将溶液定容至1 L。
 5.高温高压灭菌后,室温保存。
注意:应使溶液冷却至室温后再调定pH值,因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大,温度每升高l℃,溶液的pH值大约降低0.03个单位。

1 0×TE Buffer (pH7.4, 7.6,8.0)   
组份浓度  100 mM Tris-HCl,10 mM EDTA
配制量  1 L
配制方法  1.量取下列溶液,置于l L烧杯中。
1 M Tris-HCl Buffer(pH7.4,7.6,8.0)  100 ml
500 mM EDTA(pH8.0)  20 ml
 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水,均匀混合。
 3.将溶液定容至1 L后,高温高压灭菌。
 4.室温保存。

3 M醋酸钠(pH5.2)  
组份浓度  3 M醋酸钠
配制量  100 ml
配制方法  1.称量40.8 g NaOAc•3H2O置于100~200 ml烧杯中,加入约40 ml的去离子水搅拌溶解。
 2.加入冰醋酸调节pH值至5.2。
 3.加去离子水将溶液定容至100 ml。
 4.高温高压灭菌后,室温保存。

PBS Buffer  
组份浓度  137 mM NaCl,2.7 mM KCl,10 mM Na2HPO4,2 mM KH2PO4
配制量  1 L
配制方法  1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。
NaCl  8 g
KCl    0.2 g
Na2HPO4  1.42 g
KH2PO4  0.27 g
 2.向烧杯中加入约800 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
 3.滴加浓HCl将pH值调节至7.4,然后加入去离子水将溶液定容至1 L。
 4.高温高压灭菌后,室温保存。
注意:上述PBS Buffer中无二价阳离子,如需要,可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。

10 M醋酸铵  
组份浓度  10 M醋酸铵
配制量  100 ml
配制方法  1.称量77.1 g醋酸铵置于100~200 ml烧杯中,加入约30 ml的去离子水搅拌溶解。
 2.加去离子水将溶液定容至100 ml。
 3.使用0.22 µm滤膜过滤除菌。
4.密封瓶,室温保存。
注意:醋酸铵受热易分解,所以不能高温高压灭菌。

Tris-HCl平衡苯酚  
配制方法  1.使用原料:大多数市售液化苯酚是清亮无色的,无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色,应避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚,结晶苯酚必须,160℃对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物,这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此,苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要,我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。
 2.操作注意:苯酚腐蚀性极强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行,与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗,并用肥皂和水洗涤,忌用乙醇。
 3.苯酚平衡:因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相,因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上,苯酚平衡操作方法如下:
 ①液化苯酚应贮存于-20℃,此时的苯酚呈结晶状态。从冰柜中取出的苯酚首先在室温下放置使其达到室温,然后在68℃水浴中使苯酚充分融解。
 ②加入羟基喹啉(8-Qulnollnol)至终浓度0.1%。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂,同时因其呈黄色,有助于方便识别有机相。
 ③加入等体积的1 M Tris-HCl(pH8.0),使用磁力搅拌器搅拌l5min,静置使其充分分层后,除去上层水相。
 ④重复操作步骤③。
 ⑤加入等体积的0.1 M Tris-HCl(pH8.0)。使用磁力搅拌器搅拌l5min,静置使其充分分层后,除去上层水相。
 ⑥重复操作步骤⑤,稍微残留部分上层水相。
 ⑦使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。
 ⑧将苯酚置于棕色玻璃瓶中4℃避光保存。

苯酚/氯仿/异戊醇  
配制方法  l.说明:从核酸样品中除去蛋白质时常常使用苯酚,氯仿/异戊醇(25:24:1)。氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离,而异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡。  
 2.配制方法:将Tris-HCl平衡苯酚与等体积的氯仿/异戊醇(24:1)混合均匀后,移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

10%(W/V)SDS  
组份浓度  10%(W/V)SDS
配制量  100 ml
配制方法  1.称量10 g高纯度的SDS置于100~200 ml烧杯中,加入约80 ml的去离子水,68℃加热溶解。
 2.滴加浓HCl调节pH值至7.2。
 3.将溶液定容至100 ml后,室温保存。

2 N NaOH  
组份浓度  2 N NaOH
配制量  100 ml
配制方法  1.量取80 ml去离子水置于100~200 ml塑料烧杯中(NaOH溶解过程中大量放热,有可能使玻璃烧杯炸裂)。
 2.称取8 g NaOH小心地逐渐加入到烧杯中,边加边搅拌。
 3.待NaOH完全溶解后,用去离子水将溶液定容至100 ml。
 4.将溶液转移至塑料容器中后,室温保存。

2.5 N HCl  
组份浓度  2.5 N HCl
配制量  100 ml
配制方法  1.在78.4 ml的去离子水中加入21.6 ml的浓HCl(11.6 N),均匀混合。
 2.室温保存。

5 M NaCl  
组份浓度  5 M NaCl
配制量  1 L
配制方法  1.称量292.2 g NaCl置于1 L烧杯中,加入约800 ml的去离子水后搅拌溶解。
 2加去离子水将溶液定容至1 L后,适量分成小份。  
 3.高温高压灭菌后,4℃保存。

20%(W/V)Glucose(葡萄糖)
组份浓度  20%(W/V)Glucose
配制量  100 ml
配制方法  1.称取20 g Glucose置于100~200 ml烧杯中,加入约80 ml的去离子水后。搅拌溶解。
 2.加去离子水将溶液定容至l 00 ml。
 3.高温高压灭菌后,4℃保存。

Solution l (质粒提取用)
  组份浓度  25 mM Tris-HCl(pH8.0),10 mM EDTA,50 mM Glucose
配制量  1 L
配制方法  1.量取下列溶液,置于l L烧杯中。
1 M Tris-HCl(pH8.0)  25 m
0.5 M EDTA(pH8.0)  20 m
20% Glucose(1.11 M)  45 m
dH2O  910 m
 2.高温高压灭菌后,4℃保存。
 3.使用前每50 ml的Solution l中加入2 ml的RNase A(20 mg/ml)。

Solution Ⅱ(质粒提取用)
组份浓度  200 mM NaOH,1%(W/V)SDS
配制量  500 ml
配制方法  1.量取下列溶液,置于500 ml烧杯中。
10%SDS  50 ml
2NNa0H  50 ml
 2.加灭菌水定容至500 ml,充分混匀。
 3.室温保存。此溶液保存时间最好不要超过一个月。
注意:SDS易产生气泡,不要剧烈搅拌。

Sol ution Ⅲ(质粒提取用)
组份浓度  3 M KOAc,5 M Ethanoic acid (乙酸)
配制量  500 ml
配制方法  1.称量下列试剂,置于500 ml烧杯中。
KOAc  147g
Ethanoic acid  57.5ml
 2.加入300 ml去离子水后搅拌溶解。
 3.加去离子水将溶液定容至500 ml。
 4.高温高压灭菌后,4℃保存。

0.5 M EDTA (pH8.0)  
组份浓度  0.5 M EDTA
配制量  1 L
配制方法  1.称取186.1 g Na2EDTA•2H2O,置于1 L烧杯中。
 2.加入约800 ml的去离子水,充分搅拌。
 3.用NaOH调节pH值至8.0(约20gNaOH)。
   注意:pH值至8.0时,EDTA才能完全溶解。
 4加去离子水将溶液定容至1 L。
 5.适量分成小份后,高温高压灭菌。
 6.室温保存。

1 M DTT  
组份浓度  1 M DTT
配制量  20 ml
配制方法  1.称取3.09 g DTT,加入到50 ml料离心管内。
 2.加20 ml的0.01 M NaOAc(pH5.2),溶解后使用0 22 µm滤膜过滤除菌。
 3.适量分成小份后,-20℃保存。

10 mM ATP  
组份浓度  10 mM ATP
配制量  20 mL
配制方法  1.称取121 mg Na2ATP•3H2O,加入到50 ml塑料离心管内。
 2. 加20 ml的25 mM Tris-HCl(pH8.0),搅拌溶解。
 3.适量分成小份后,-20℃保存。

蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制方法

二、蛋白质电泳相关试剂、缓冲液的配制方法

30%(W/V)Acrylamide(丙烯酰胺)
组份浓度  30%(W/V)Acrylamide
配制量  1 L
配制方法  1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。
Acrylamide  290 g
BIS(双丙烯酰胺)  10 g
 2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
 3.加去离子水将溶液定容至l L,用0.45 µm滤膜滤去杂质。
 4.于棕色瓶中4℃保存。
注意:丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成份。

40%(W/V)Acrylamide  
组份浓度  40%(W/V)Acrylamide
配制量  1 L
配制方法  1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。
Acrylamide  380 g
BIS  20 g
 2.向烧杯中加入约600 ml的去离子水,充分搅拌溶解。
 3.加去离子水将溶液定容至l L,用0.45 µm滤膜滤去杂质。
 4.于棕色瓶中4℃保存。
注意:丙烯酰胺具有很强的神经毒性,并可通过皮肤吸收,其作用具有积累性,配制时应戴手套等。聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为有可能含有少量的未聚合成份。

10%(W/V) AP (过硫酸铵)
组份浓度  10%(W/V)AP
配制量  10 ml
配制方法  1.称取1 g AP。
 2.加入10 ml的去离子水后搅拌溶解。
 3.贮存于4℃。
注意:1 0%过硫酸铵溶液在4℃保存时可使用2周左右,超过期限会失去催化作用。

5×Tris-Glyclne Buffer (SDS-PAGE电泳缓冲液)
组份浓度  0.125 M Tris,1.25 M Glyclne(甘氨酸),0.5%(W/V)SDS
配制量  1 L
配制方法  1.称量下列试剂,置于l L烧杯中。
Tris  15.1 g
Glyclne  94 g
SDS  5.0 g
 2.加入约800 ml的去离子水,搅拌溶解。
 3.加去离子水将溶液定容至1 L后,室温保存。

2×SDS -PAGE Loading Buffer
组份浓度
100 mM  Tris-HCl(pH6.8)
100 mM  β-巯基乙醇(2-ME)
4%(W/V)  SDS
0.2%(W/V)  溴酚兰(BPB)
20%(V/V)  甘油
配制量  5 ml
配制方法  1.量取下列试剂,置于10 ml塑料离心管中。
0.25 M Tris-HCl(pH6.8)  0.25 ml
β-巯基乙醇  0.5 ml
SDS  0.2 g
甘油  1 ml
1%溴酚兰  0.1 ml,
2.加去离子水溶解后定容至5 ml。
 3.小份(500 µl/份)分装后,于室温保存。
 4.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右

5×SDS-PAGE Loading Buffer
250 mM  Tris-HCl(pH6.8)
10%(W/V)  SDS
0.5%(W/V)  BPB
50%(V/V)  甘油
5%(W/V)  2-ME
组份浓度





配制量  5 ml
配制方法  1.量取下列试剂,置于10 ml塑料离心管中。
1 M Tris-HCl(pH6.8)  1.25 ml
SDS  0.5 g
BPB  25 mg
甘油  2.5 ml


 
 

2.加去离子水溶解后定容至5 ml。
 3.小份(500 µl/份)分装后,于室温保存。
 4.使用前将25 µl的2-ME加到每小份中。
 5.加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。

考马斯亮蓝R-250染色液
组份浓度  0.1%(W/V)考马斯亮蓝R-250,25%(V/V)异丙醇,10%(V/V)冰醋酸
配制量  1 L
配制方法  1.称取1 g考马斯亮蓝R-250,置于1 L烧杯中。
 2.量取250 ml的异丙醇加入上述烧杯中,搅拌溶解。
 3.加入100 ml的冰醋酸,搅拌均匀。
 4.加入650 ml的去离子水,搅拌均匀。
 5.用滤纸除去颗粒物质后,室温保存。

考马斯亮蓝染色脱色液   
组份浓度   10%(V/V) Ethanoic acid,30%(V/V)乙醇
配制量    1 L
配制方法   1.量取下列溶液,置于l L烧杯中。
Ethanoic acid  100 ml
乙醇  300 ml
dH2O  600 ml
 2.充分混合后使用。

凝胶固定液(SDS-PAGE银氨染色用)
组份浓度   50%(V/V)甲醇,10%(V/V) Ethanoic acid
配制量    100 ml
配制方法   1.量取下列试剂,加入100~200 ml的试剂瓶中。
甲醇  500 ml
Ethanoic acid  100 ml
dH2O  400 ml
   2.均匀混合后室温保存。
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